Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия - Fluorescence cross-correlation spectroscopy

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) был представлен Эйген и Риглер в 1994 г.[1] и экспериментально реализовано Schwille в 1997 г.[2] По сути, это расширение флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) с использованием двух разноокрашенных молекул вместо одной. Другими словами, совпадающие флуктуации интенсивности зеленого и красного разных молекул коррелируют, если частицы, помеченные зеленым и красным, движутся вместе через заранее определенный конфокальный объем. В результате FCCS обеспечивает высокочувствительное измерение молекулярных взаимодействий независимо от скорости диффузии. Это важное достижение, учитывая, что скорость диффузии слабо зависит от размера молекулярного комплекса.[3]

Карикатура с фокусным объемом FCCS

FCCS использует два вида, которые независимо помечены двумя флуоресцентными зондами разного цвета. Эти флуоресцентные зонды возбуждаются и обнаруживаются двумя разными источниками лазерного света и детекторами, обычно обозначенными как «зеленый» и «красный». Обычно конфокальный микроскоп используется для обеспечения перекрытия зеленого и красного фокусных объемов для возбуждения.

Моделирование FCCS, демонстрирующее невзаимодействующие частицы (слева) и смесь взаимодействующих и независимых частиц (справа)

Нормализованная функция взаимной корреляции определена для двух флуоресцентных видов. и которые являются независимыми зелеными, G и красными, R каналами, а именно:

где дифференциальные флуоресцентные сигналы в определенное время, и во время задержки, позже соотносятся друг с другом. В отсутствие спектрального просвечивания функция взаимной корреляции равна нулю для невзаимодействующих частиц. В отличие от FCS, функция взаимной корреляции увеличивается с увеличением числа взаимодействующих частиц.

FCCS в первую очередь используется для измерения биомолекулярных взаимодействий как в живых клетках, так и in vitro.[4][5] Его можно использовать для измерения простых молекулярных стехиометрий и констант связывания.[6] Это один из немногих методов, который может предоставить информацию о белок-белковых взаимодействиях в определенное время и в определенном месте в пределах живой клетки. В отличие от флуоресцентный резонансный перенос энергии, у него нет ограничения по расстоянию для взаимодействий. В результате его можно использовать для исследования больших комплексов. Тем не менее, для этого требуется, чтобы комплексы активно диффундировали через фокус микроскопа в относительно короткий промежуток времени (обычно секунды).

Моделирование

Кривые взаимной корреляции моделируются в соответствии с несколько более сложной математической функцией, чем применяемая в FCS. Прежде всего, эффективный наложенный объем наблюдения, в котором каналы G и R образуют единый объем наблюдения, в растворе:

куда и - радиальные параметры и и - аксиальные параметры для каналов G и R.

Время диффузии, для дважды (G и R) флуоресцентных частиц описывается следующим образом:

куда - коэффициент диффузии дважды флуоресцентной частицы.

Кривая взаимной корреляции, полученная при диффузии дважды меченых флуоресцентных частиц, может быть смоделирована в отдельных каналах следующим образом:

В идеальном случае функция взаимной корреляции пропорциональна концентрации дважды меченого флуоресцентного комплекса:

с

Амплитуда взаимной корреляции прямо пропорциональна концентрации двухкомпонентных (красных и зеленых) видов. [7]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Эйген, М. и Риглер, Р. Сортировка отдельных молекул: применение в диагностике и эволюционной биотехнологии. (1994) Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 91, 5740-5747.
  2. ^ Schwille, P .; Myer-Almes, F.J .; Риглер, Р. Двухцветная кросс-корреляционная флуоресцентная спектроскопия для многокомпонентного диффузионного анализа в растворе. (1997) Биофиз. Дж. 72, 1878-1886.
  3. ^ Ито, К .; Isobe, K .; Ватанабе В. Функциональная визуализация с помощью управляемых нелинейных оптических явлений. (2013) Джон Уайли и сыновья
  4. ^ Bacia, K .; Kim, S.A .; Швилл, П. Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия в живых клетках. (2006) Nat. Meth. 3, 83-89 .
  5. ^ Слотер, Б.Д .; Unruh, J. R .; Ли, Р. Спектроскопия флуоресцентных флуктуаций и методы визуализации для изучения динамических взаимодействий белков в дрожжах. В методах молекулярной биологии: системная биология дрожжей. J.I. Castrillo, S.G.Oliver, Eds. (Спрингер, Нью-Йорк, 2011). Vol. 759, г. С. 283-306.
  6. ^ Чен, Ю. и Мюллер, Дж. Д. Определение стехиометрии белковых гетерокомплексов в живых клетках с помощью флуоресцентной флуктуационной спектроскопии. (2006) Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 104, 3147-3152.
  7. ^ http://www.rci.rutgers.edu/~moghe/biophy%20j%2083_1184.pdf

внешняя ссылка